高效液相色谱仪应用分析

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一、生物化学
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，几乎遍及定量定性分析的各个领域。HPLC可将不同的蛋白质分离并检测，不但有很高的灵敏度且实现了分析自动化，对医药、临床病理、预防学等蛋白质化学领域的研究提供了强有力的手段。HPLC应用于细菌的分子生物学鉴定和细菌细胞的化学成分分析可直接测定细菌DNA的碱基组成和细菌的化学组分，为细菌的分类鉴定提供有利的证据。但是HPLC在具体分析的过程中还有很多问题有待解决。相信高效液相色谱这种分析方法随着仪器分析技术的不断发展必然将会对生物学领域做出更大的贡献。
1、高效液相色谱法在微生物分析鉴定中的应用
HPLC应用于细菌的分子生物学鉴定和细菌细胞的化学成分分析可直接测定细菌DNA 的碱基组成和细菌的化学组分，为细菌的分类鉴定提供有利的证据。因此，HPLC 在微生物鉴定中的应用越来越受到人们的关注。
（1）细菌DNA 的G+ C含量测定
每一种细菌DNA G+ C含量通常是恒定的，不受菌龄、生长条件等各种外界因素的影响，故它作为鉴定细菌种、属间的亲疏关系的重要指标已被人们所公认。在伯杰细菌系统学手册中将细菌DNA G+C含量作为细菌分类鉴定的重要指标，可见细菌DNA的G+C含量测定在细菌鉴定中的重要性。DNA经酶水解后得四种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，它们的化学结构中均存在共轭双键，在260nm波长处有最大吸收，因此可用常见的UV—HPLC 法直接测定细菌DNA G+C含量。测定DNA G+C含量的方法已有众多研究报道，主要包括热变性温度（Tm）法、浮力密度法和HPLC法，其中快速、准确的方法当HPLC法。
通常情况下，中性分子在反相色谱柱中具有更好的柱效。
HPLC测定细菌DNA G+C含量是一个快速、准确可靠的方法。但是，在应用这个方法时应注意下列几点：
细菌DNA应高度纯化，按常规方法提取与纯化的细菌DNA，不宜直接用HPLC测定G+C含量。样品中残留的RNA等明显影响G+C含量测定的准确性，必须用核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1进一步处理。否则，较多的杂质峰将影响碱基峰的形成而使G+C含量测定出现较大误差。
测定细菌DNA的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷均可计算出DNA G+C含量。但应注意，测定核苷酸时宜选用离子交换色谱系统，而测定核苷时宜选用反相色谱系统。
荧光检测器比紫外检测器的灵敏度高，在条件具备或样品量很低时，尽量选择荧光检测。
（2）枝菌酸的分析
枝菌酸是一类仅存手棒状杆菌（C20～C38）、迪茨氏菌属（C34～C38）、红球菌属（C34～C52）、诺卡菌属（C40～C60）、戈登氏菌属（C48～C66）、williamsia （C50～C56）、Skermania （C50～C64）、冢村氏菌属（C64～C78）和分枝杆菌（C60～C90）细胞壁中的α2烷基、β2羟基高分子脂肪酸。二维薄层层析和质谱证实各种分枝杆菌中含不同的枝菌酸。HPLC 能够分离各枝菌酸是基于枝菌酸碳链长度、不饱和度和其官能团，而HPLC分类、鉴定含枝菌酸细菌是基于各枝菌酸溴代苯甲酰脂肪酸酯的特征图谱或保留时间不同。将样品测定图谱与已发表的分枝杆菌参考图谱比较可进行鉴定，若没有标准参考图谱，可利用标准株或基因鉴定菌株制备。HPLC可鉴定分枝杆菌到种的水平。
HPLC是一个快速、简便和费用低廉的种特异性鉴定分枝杆菌的方法，值得大力推广应用。但是HPLC 鉴定分枝杆菌需要标准图谱作为对照，鉴定时需要参考文献图谱，建议最好购买现成的分枝杆菌图谱数据库或自行建立数据库并结合计算机辅助进行鉴定。随着鉴定数量的不断增加，可将鉴定到的新菌种图谱不断充实到数据库中，使得鉴定范围不断扩大，从而使其真正成为在临床或实验室进行分类鉴定分枝杆菌的常规手段。
（3）醌类的分析
醌是细菌细胞质膜和线粒体膜的组成成分，在电子传递链和氧化磷酸化中起重要作用。除了具有这些重要的生理功能，类异戊二烯醌作为细菌分类的重要化学指标常用于细菌的分类鉴定。许多研究表明细菌中含有的两个主要类型的醌一萘醌和苯醌均具有类异戊二烯侧链，而且侧链各不相同，醌的类型（泛醌、甲基萘醌和它们的衍生物二氢甲基萘醌、二甲基甲基萘醌和深红醌）、类异戊二烯侧链长度和饱和度构成了化学分类鉴定细菌之基础。高效薄层层析（HPTLC）可有效地分析泛醌类异戊二烯侧链，但分析甲基萘醌类异戊二烯侧链受到限制。反相薄层层析（RP-TLC） 虽能有效地分析甲基萘醌，但分析甲基取代的甲基萘醌不够理想。高效液相色谱法（HPLC）在以上存在的两种情况中均能有效地进行分析。以紫外检测高效液相色谱仪、RPl8 柱（5μm粒径，150×4. 6 mm）、270nm检测波长分析醌。通过与可靠的标准品比较鉴定各种类型的醌，当用HPLC分析细菌中醌类鉴定细菌时，必须将测定样品与标准品图谱对照。因为HPLC分析醌类鉴定细菌是定性分析细菌中的醌，分析条件的微小变化都会影响某种醌保留时间的长短，使我们无法进行正确判断。此外，仅靠一张HPLC图谱就对细菌作出鉴定难免有些草率。因此，准确鉴定时，除了进行HPLC测定外，还应作紫外光谱、质谱和核磁共振谱分析。
（4）多胺的分析
多胺是构成细菌细胞的化学成分，它的类型可作为细菌化学分类的标志。目前，已经证明多胺的类型可用于属于蛋白菌类的革兰氏阴性菌的分类鉴定，它在革兰氏阳性菌分类鉴定中的作用还没有得到完全证实。一般α-亚类蛋白菌主要含三胺（亚精胺或对称一同系亚精胺）；β-亚类蛋白菌具有同系多胺类型，它们共同的特征为主要含丁二胺；γ-亚类蛋白菌肠杆菌科欧文菌属主要含二氨基丙烷和丁二胺，相关的弧菌属主要含三胺（对称一正亚精胺）；黄单胞菌属、弗拉特氏菌属、盐单胞菌属、德莱氏菌属和海洋螺菌属的共同特征为主要含亚精胺，寡养单胞菌属主要含戊二胺和亚精胺。将干燥菌置于试管中，加入一定量0. 2mol/ L 高氯酸，100℃加热30min，离心后，上清液在60℃进行碱化和旦磺酰化，然后加脯氨酸溶液除去多余的旦磺酰氯，用甲苯抽提出旦磺酰多胺备用。采用RPl8色谱柱、荧光检测器和乙腈/ 水梯度洗脱系统进样分析旦磺酰多胺。
多胺的分析可用于细菌的分类鉴定，但仅适用于某些革兰氏阴性菌，况且仅依靠多胺的类型不能完全确定某种菌，因此用本法分类鉴定细菌时需与其它方法进行比较，防止得出错误的结论。
2、利用高效液相色谱（HPLC）分离蛋白质
蛋白质在物理、化学及功能等特征上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性以及蛋白质的来源、实验要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质。
（1）反相高效液相色谱
在HPLC各种模式中，RP-HPLC应用最为广泛。其固定相是非极性的，而流动相是比固定相极性更强的溶剂系统。蛋白质分子疏水性的不同使其在两相中的分配不同而得到分离。近10几年来，RP-HPLC以其高分辨力、快速、重复性好等优点广泛应用于蛋白质的分离分析。
有利于蛋白质分离的条件于1970年首次提出，即低pH值流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分。三氟乙酸（ TFA）作为离子对试剂，是反相色谱中最常用的添加剂。蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质有关，实验证明，大孔硅胶（20～30nm）短链烷基键合固定相适合蛋白质的分离；另外，无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的蛋白质混合物的分离效果很好。从分子量6000的胰岛素到分子量66000的牛血清白蛋白在无孔径载体柱上均能得到良好的分离，并且分离速度很快（一般2～5min），较高的柱温还能改善蛋白质混合物的分离；Daniel B. Wall等利用C18非多孔硅粒载体柱实现了细胞溶菌物中蛋白质的快速分离。并且，利用这种方法，在15min内大肠杆菌的整个细胞溶菌物水溶液中的蛋白就可以得到很好的分离。
（2）高效离子交换色谱
HPIEC是根据蛋白质分子在一定的pH和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。这种技术已经成功地用于分离蛋白质，并且，当选择的流动相的 pH 值合适时能维持蛋白质的生物活性。由于HPIEC是一吸附性的梯度洗脱过程，所以具有很好的负载力。近几年来HPIEC也成为分离检测蛋白质的重要方法。并且，人们的研究证明HPIEC与RP-HPLC都是分离膜蛋白的首选方法。 在离子交换色谱填料研究方面，聚合物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。
（3）高效凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC），是根据分子相对大小进行分离的一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而言， SEC的分辨力和样品负载力都很低。SEC又是一种温和的技术，可用来平衡柱及分离样品的缓冲液范围较广。所以近年来关于利用SEC 分离蛋白质的报道也不少。例如，Bunger H等成功的分离出疏水性肺的表面活性剂蛋白SP-B、SP-C；另外SEC特别适合对蛋白质分子量的研究，利用SEC 能够快速分离出人血清白蛋白HAS的降解产物，结合特定的检测器即可测定其单体和二聚体的分子量。
（4）高效亲和色谱
蛋白质在行使功能时必须和底物、受体或抑制剂等分子进行生物专一性结合，这种高度专一性结合特性可用于亲和色谱分离。HPAFC是蛋白质检测中最专一的分离技术，可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。周冬梅等研究了蛋白A高效亲和色谱对水溶液及人血浆中免疫球蛋白G（HIgG）的特异性吸附和定量测定，方法具有较高的精确度和重复性。通过HPAFC可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等，也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等，可见HPAFC在蛋白质化学中起着重要作用。
（5）其他液相色谱模式
高效疏水色谱（HIC）是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一，其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂；以键合氟化物作固定相，用SDS或CTAB作流动相的胶束高效液相色谱中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离；近年来，人们将非线性色谱理论应用于蛋白质分离中，更加完善了高效液相色谱技术。在实际应用中，特别是复杂样品，通常采用几种分离模式结合使用才能获得理想的目标产物。
3、蛋白质分离检测的HPLC联用技术
为了使蛋白质的检测更加准确方便，人们研究了各种HPLC联用技术。目前常用的比较成功的联用技术主要有：高效液相色谱—质谱（HPLC-MS）、高效液相色谱—毛细管电泳（HPLC-CE）、高效液相色谱—等速电泳（HPLC-ITP）、高效液相色谱—电感耦合等离子体原子发射光谱（HPLC-ICP-AES）。
（1）HPLC-MS联用技术
HPLC-MS 联用技术是近年来研究的热点，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。随着电喷雾（ ESI）接口技术的发展，HPLC-ESI-MS 联用技术为蛋白质的检测提供了强有力的工具。这种技术耗样量少、精确度高、快速方便，并且可以用于不纯或者复杂混合物的分析。我国研究工作者利用HPLC-ESI-MS联用技术对溶菌酶和牛血清蛋白分别进行定性定量分析以及对其混合物进行检测，取得了较满意的结果。另外，HPLC-MS-MS 联用因其通用性以及高灵敏度在蛋白质分析中也有着重要的应用。
（2）HPLC-CE联用技术
HPLC-CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离。在分离检测复杂蛋白质样品时，HPCE可以作为HPLC的补充，有时利用HPLC无法分离的蛋白质在HPCE上即可得到很好的分离。另外，毛细管区带电泳（CZE）与HPLC联用也可以很好的分离检测一些蛋白质。
（3）HPLC – ITP联用技术
高效液相色谱和等速电泳都是近年来发展较快的分离分析方法，二者联用可以分离分析成分和复杂的蛋白质样品。曾经有人将ITP作为一种预处理技术与 HPLC联用，我国研究工作者建立了新的联用系统，成功地研究了含蛋白质和一些金属离子的复杂样品的分离分析。
（4）HPLC-ICP-AES联用技术
ICP-AES是十分重要的化学形态分析技术，HPLC与ICP-AES的结合使之具有多元素同时检测的特性。国外科学家利用此联用技术对人类肝部的金属硫蛋白中的金属分布作了准确的定性定量分析。